Главная страница

методичка Использование ДНК- технологий в медиц... Использование днк- технологий в медицине


Скачать 237.5 Kb.
НазваниеИспользование днк- технологий в медицине
Анкорметодичка Использование ДНК- технологий в медиц.
Дата01.10.2017
Размер237.5 Kb.
Формат файлаdoc
Имя файламетодичка Использование ДНК- технологий в медиц...doc
ТипДокументы
#16318
Каталогnashkho95

С этим файлом связано 32 файл(ов). Среди них: 40 хадисов имама Навави.doc, методичка Использование ДНК- технологий в медиц...doc, тесты 7 мод..docx, 3. Толстый киш. Печень. Пищев повед.ppt.ppt, Ibn_Baaz-4_pravila.pdf, лучевая диаг.самост.работа. 4 леч. 3 м.проф. и...doc, БА и АРДокумент Microsoft Office Word (4).docx, 2.ПИЩЕВАРЕНИЕ В ТОНКОМ КИШЕЧНИКЕ.ppt.ppt и ещё 22 файл(а).
Показать все связанные файлы

Тема: Использование ДНК- технологий в медицине
I Научно-методическое обоснование темы:

Методы выделения ДНК

ДНК может быть выделена из любого типа тканей и клеток, содержащих ядро.

Этапы выделения ДНК:

  1. быстрый лизис клеток;

  2. удаление фрагментов клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования;

  3. ферментативное разрушение белков протеиназами;

  4. экстрагирование ДНК из раствора с помощью фенола и хлороформа;

  5. осаждение ДНК этанолом.

Расщепление ДНК с помощью рестриктаз

Для фрагментирования используют рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы).

Рестриктазы узнают специфические фрагменты нуклеотидов в ДНК и «разрезают» ее в местах локализации этих последовательностей.

Образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть исследованы методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Выявление ДНК в геле производится при взаимодействии с бромидом эдития, при этом комплексное соединение окрашивается в розовый цвет.

Идентификация специфических последовательностей:

Идентификация в геле нужных фрагментов осуществляется путем гибридизации с меченными ДНК-зондами (искусственно синтезированные фрагменты ДНК со строго определенной первичной структурой).

Классическим методом идентификации исследуемого участка ДНК стал блот-гибридизация по Саусерну. Суть метода: фрагменты ДНК полученные в результате деления по молекулярной массе в геле, подвергают денатурации и переносят с геля на твердый носитель. Перенос (блоттинг) осуществляется капиллярных сил, электрического поля. Фиксированную на фильтре ДНК гибридизируют с ДНК-зондом, содержащием метку. Методом радиоавтографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме.

Установление первичной структуры ДНК-фрагмента (секвенирование ДНК)

Для установления первичной структуры ДНК-фрагмента используют дидезоксисеквенирование.

Денатурированную однонитевую ДНК помещают вместе с ДНК-полимеразой и дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ - один из них радиоактивный).

Получение рекомбинантных ДНК и их амплификация

Получение рекомбинантных ДНК включает следующие этапы:

  1. выделение ДНК из двух разных источников;

  2. фрагментирование их разными рестриктазами;

  3. нагревание и медленное охлаждение, образование фрагментов;

  4. добавление 4 ддНТФ и синтез ДНК-копий.

Клонирование ДНК осуществляется за счет встраивания исследуемого фрагмента ДНК в векторную молекулу (плазмид, фаг, вирус), которая способствует проникновению этого фрагмента внутрь бактериальных клеток. В основном, для этой цели используют плазмиды – это небольшие кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, присутствующие в бактериальных клетках, обладающие автономной системой контроля репликации. При этом трансформированные бактерии, т.е. введенные в них плазмиды, синтезируют копии введенного фрагмента ДНК.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, 1983 Карри Муллисон)

Амплификация in vitro

При данном методе используют ДНК-матрицы (образцы). Участок исследуемой ДНК гибридизируют с двумя исскуственно синтезированными олигодезоксирибонуклеотидными последовательностями – праймерами.

В реакционную смесь входят: термофильный фермент ДНК-полимераза бактерий (Taq-полимераза), исследуемая ДНК, субстраты реакций (4 дНТФ), два праймера, буфер с ионами магния.

Один цикл полимеризации включает 3 этапа:

  1. плавление (нагревают смесь до t 90-97ºС при этом происходит денатурация ДНК);

  2. гибридизация ( отжиг ДНК с праймерами), при этом происходит снижение t до 50-60ºС и происходит комплементарное связывание двухцепочечного участка на каждой из нитей ДНК;

  3. Элонгация – удлинение нитей ДНК, катализируемое Taq-полимеразой в 5’-3’ направлении.

Данный процесс осуществляется в специальных аппаратах – амплификаторах. С помощью ПЦР можно получить достаточное количество копий участков ДНК, которые предполагают присутствие мутаций, полиморфизм сайтов, поводить диагностику инфицированности различными реагентами.

ДНК-диагностика заболеваний

С помощью рекомбинантных ДНК можно исследовать точечные мутации, вызванные заменой одного азотистого основания, делецией или вставкой, приводящими к появлению аллелей, кодирующих функционально неактивные белки. Разработаттые технологии позволяют вести целенаправленное картирование генов человека в рамках международного проекта «Геном человека». Для идентификации моногенных болезней используют следующие методы:

1. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ);

2. Аллельспецифические пробы.

ПДРФ – анализ это метод, при котором определяется нечувствительность участков с мутацией к действию рестриктаз, с помощью измерения длины рестрикционных фрагментов.

ПДРФ – анализ включает следующие этапы:

  1. выделение геномной ДНК;

  2. рестрикция специфической эндонуклеазой;

  3. электрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК;

  4. Идентификация фрагментов по методу блот-гибридизации по Саузерну.

При этом на электрофорезе выявляется один крупный фрагмент или наоборот небольшой фрагмент.

Данный метод позволяет идентифицировать делецию в гене дистрофина (миодистрофия Дюшена), диагностировать гемофилию А, талассемии, гранулематоз, контролировать здоровье детей в семье и т.д.

Аллельспецифические пробы

С помощью аллель - олигонуклеотидов определяют те участки, которые не узнают ферменты рестрикции. Для этого синтезируют короткие олигонуклеотидные зонды, комплементарные участку нормального и мутантного аллеля в ДНК. Область генома, содержащую исследуемый ген, амплифицируют с помощью ПЦР, и образцы полученной ДНК переносят на нитроцеллюлозные фильтры (дот- или слот-блоттинг). Пробы выдерживают с 32Р-зондами для выявления нормальной или мутантной последовательности.

Олигонуклеотиды, аллель-специфические по определенным мутация, можно использовать в качестве праймеров в ПЦР при клиническом тестировании населения на наличие патологического гена.

Использование ДНК-технологий для получения лекарственных препаратов и лечения различных болезней.

Вакцины – очищенные белки, антипенные детерминанты ряда возбудителей ряда возбудителей вирусных и бактериальных инфекций. Для этого используют технику рекомбинантных ДНК.

Белки, имеющие терапевтическое значение, получают с использованием этой технологии во многих странах мира. Так получают инсулин, гормон роста, фактор VIII, тканевой активатор плазмина (участвует в процессе фибринолиза и предотвращает образование тромба), интерлейкины, колоний стимулирующий фактор, эритропоэтин и др.

Генная терапия – лечение наследственных, многофакторных и инфекционных заболеваний путем введения в соматические клетки пациентов генов, которые обеспечивают исправление генных дефектов или придают клеткам новые функции.

Генная терапии in vivo основана на прямом введении в специализированные ткани больного клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК, поступающих в определенные клетки с помощью рецепторов.

Интерферон (Interferonum) является низкомолекулярным белком, обладающим противовирусными свой­ствами.

Его рассматривают как противовирусный антибиотик и как фактор неспецифической защиты ор­ганизма от первичной вирусной инфекции.

В медицин­ской практике используют интерферон, образуемый лейкоцитами донорской крови человека в ответ на воз­действие вируса интерфероногена.
Применяют этот противовирусный препарат в ампулах по 2 мл (порошок), также есть гели и мази с интерфероном человеческим.

Раствор готовят на дистиллированной или кипяченой воде комнатной температуры и используют в виде аппликаций на слизистую оболочку рта или ингаляций в ротовую полость.
Источник: http://alvistom.com/publ/lekarstvennye_sredstva_v_stomatologii/protivovirusnye_preparaty_v_stomatologii_protivovirusnye_lekarstvennye_sredstva/5-1-0-5
II Цель деятельности студентов на занятии

Студент должен знать:

  1. Рестриктазы, механизм их действия;

  2. Как происходит расщепление ДНК с помощью рестриктаз;

  3. Основной смысл фрагментирования ДНК;

  4. Как осуществляется идентификация специфических последовательностей в молекуле ДНК;

  5. Методику секвенирования ДНК;

  6. Получение рекомбинантных ДНК;

  7. Как осуществляется амплификация фрагментов ДНК;

  8. Основу метода клонирования ДНК и его значение;

  9. Как используют знания последовательности нуклеотидов в ДНК для диагностики заболеваний, получения лекарственных препаратов и лечения различных болезней;

  10. Какими свойствами обладает интерферон.

Студент должен уметь объяснить:

  1. Методы выделения ДНК;

  2. Метод блот-гибридизации по Саузерну;

  3. Принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР);

  4. Методы идентификации моногенных мутаций:

III Содержание обучения:

  1. Методы выделения ДНК;

  2. Рестриктазы, механизм их действия;

  3. Расщепление ДНК с помощью рестриктаз;

  4. Основной смысл фрагментирования ДНК;

  5. Как осуществляется идентификация специфических последовательностей в молекуле ДНК;

  6. Как осуществляется секвенирование ДНК;

  7. Получение рекомбинантных ДНК;

  8. Как осуществляется амплификация фрагментов ДНК;

  9. Клонирование ДНК: основа метода, его значение;

  10. Использование ДНК для диагностики заболеваний;

  11. Использование ДНК-технологий для получения лекарственных препаратов и лечения различных болезней.

  12. Метод блот-гибридизации по Саузерну;

  13. Принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР);

  14. Методы идентификации моногенных мутаций:

  15. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов;

  16. Аллельспецифические пробы;

  17. Какими свойствами обладает интерферон.

Основные вопросы:

  1. Методы выделения ДНК:

    • Метод блот-гибридизации по Саузерну;

    • Принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР);

  1. Методы идентификации моногенных мутаций:

    • Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов;

    • Аллельспецифические пробы.

IV Перечень лабораторных работ, наглядных пособий и средств ТСО.
Наглядные пособия:

Таблицы названия
Таблица 1

Идентификация специфических последовательностей

1. Молекула ДНК



2. ДНК-зонд гибридизуется с амплифицируемойпоследовательностью


3. ДНК-зонд в процессе амплификации разрушается ДНК-полимеразой и метка начинает флуоресцировать



VI Перечень вопросов для проверки исходного уровня знаний:

        1. Что такое белки?

        2. Какие уровни организации белков существуют?

        3. Свойства белков. Понятия «денатурация», «ренативация»?

        4. Что такое ДНК и РНК? Функции.

        5. Из каких мономеров они построены?

        6. Напишите формулу АМФ, выделите в ней азотистое основание, углеводный компонент, остаток фосфорной кислоты.

        7. Какие азотистые основания вы знаете?

        8. По какому принципу происходит сборка нитей ДНК и РНК?

        9. Чем ДНК отличается от РНК?


VIII Хронокарта учебного занятия:

  1. Общий бюджет времени: 3 (125);

  2. Перекличка 5 минут;

  3. Разбор основных вопросов темы 60 минут;

  4. Тестовый опрос 20 минут;

  5. Проведение лабораторной работы;

  6. Оформление протоколов 10 минут

IX Самостоятельная работа студентов:

Подготовка тестов и кроссворда по данной теме.
X Список используемой литературы:

Обязательная:

  1. Е.С. Северин «Биохимия», Москва 2003, С.212-226;

  2. Е.С. Северин «Биохимия с упражнениями и задачами», Москва 2008,

Дополнительная:

  1. Лекция;

  2. Интернет-источник


Наглядное пособие

Тема: Использование ДНК- технологий в медицине
Таблица 1

Идентификация специфических последовательностей
1. Молекула ДНК



2. ДНК-зонд гибридизуется с амплифицируемойпоследовательностью


3. ДНК-зонд в процессе амплификации разрушается ДНК-полимеразой и метка начинает флуоресцировать


перейти в каталог файлов
связь с админом