Главная страница

Концентрациирастворенного вещества у поверхности раздела двух


Скачать 0.74 Mb.
НазваниеКонцентрациирастворенного вещества у поверхности раздела двух
АнкорMetody_3-y_vopros.pdf
Дата23.06.2018
Размер0.74 Mb.
Формат файлаpdf
Имя файлаMetody_3-y_vopros.pdf
оригинальный pdf просмотр
ТипДокументы
#42116
Каталогmiriam_spektor

С этим файлом связано 17 файл(ов). Среди них: Metody_3-y_vopros.pdf, Lektsia_3.pdf, Robert_A_Weinberg_-_The_Biology_of_Cancer_2nd_ed__-_2014.pdf, Lektsia_2.pdf, Minyar-Belorucheva_A_Anglorusskie_oboroty_nauchnoy_rechi.pdf, vk_com_gifzz.gif, Lektsia_1.pdf, Lektsia_1.pdf, Lektsia_2_Osnovnye_predstavlenia_organicheskoy_khimii.pdf, матем.doc и ещё 7 файл(а).
Показать все связанные файлы


1.
Применение методов адсорбционной спектроскопии для исследования биологических объектов в ультрафиолетовой и видимой области.
Адсорбция— увеличение
концентрации
растворенного вещества у поверхности раздела двух
фаз
(
твердая фаза
-жидкость, конденсированная фаза - газ) вследствие
нескомпенсированности сил межмолекулярного взаимодействия на разделе фаз

3.
Флуоресцентные методы исследования фотосинтетических процессов.

4.
ЭПР-спектроскопия в исследовании биологических мембран.
Электронный парамагнитный резонанс- это явление резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волны системой парамагнитных частиц (электронов с некомпенсированными спинами), помещенных во внешнее магнитное поле, при резонансной частоте волны.
Далее идет теория этого метода //
Известно, что в постоянном магнитном поле напряженности Но спины электронов будут ориентироваться вдоль поля. Энергетический уровень электрона со спином s= 1/2 расщепляется на два уровня в соответствии с параллельным и антипараллельным полю Но направлением спина:
Разность энергетических уровней составляет:
-магнетрон Бора
При общем числе спинов в системе N отношение заселенностей спинов на нижнем (N1) и верхнем
(N2) уровнях определяется разностью энергий по закону Больцмана:
, где N1+N2=N, N1>N2
Наложим теперь на образец помимо постоянного Но и переменное магнитное поле с частотой v, перпендикулярное постоянному полю. Тогда в системе будут индуцироваться вынужденные переходы между уровнями с вероятностью, одинаковой для переходов N1 —- N2 и N2 —> N1. Так как исходно N1 > N2, то число переходов в каждый момент времени с нижнего на верхний уровень
N1 —> N2 превысит число обратных переходов N2 —>N1. При условии происходит резонансное поглощение энергии переменного поля. Это явление и называется электронным парамагнитным резонансом (ЭПР).
Сигнал ЭПР обладает не узкой линией, а полосой поглощения с определенной шириной. То есть на самом деле сами энергетические уровни спинового состония обладают определенной шириной Г, т. е несколько размыты.
Связь между временем существования данного состояния и шириной Г точного энер. уровня E0 дается соотн. неопределенности:

Ширина связана с характером внутримолекулярной динамики в исследуемом образце: Если вязкость мала, то за счет быстрых молекулярныхдвижений взаимные влияния спинов успевают усредниться при поглощении переменного поля. В этом случае резонанс наблюдается при усредненной линии с уменьш. шириной. Наоборот, замораживание раствора и умен. его вязкости вновь замедлят молекулярные движения. Т.о. измеряя ширину линии поглощения, можно получить данные о характере внутримолекулярных движений в микроокружении спиновой частицы(радикал, протон).
// теория метода закнчена
Метод спиновых меток. Основная идея метода состоит в присоединении к той или иной функциональной группе белка свободного радикала и изучению характеристик его сигналов ЭПР.
Наиболее удобны в этом отношении нитроксильные радикалы, содержащие свободнорадикальную группу N-O:
Неспаренный электрон принадлежит 2р-орбиталям азота и кислорода и фактически делокализован между атомами N и О, эффективно взаимодействуя по диполь-дипольному механизму с магнитным моментом спина ядра атома азота. В силу этого происходит расщепление линии поглощения сигнала ЭПР (СТС) на три составляющие, соответствующее трем разным проекциям ядерного спина азота на направление H_0
Дальнейшим развитием метода спиновых меток явилась так называемая спектроскопия ЭПР с переносом насыщения, позволяющая исследовать вращения спинметок, связанных с макромолекулами в диапазоне времен корреляции 10

7 с -103 с. Развитие этого метода
позволило изучать динамику мембранных белков, белок-белковые и белок-липидные
взаимодействия в биологических мембранах. (!!!)
Так с помощью спектроскопии с переносом насыщения была исследована динамика Са-АТФазы в мембранах саркоплазматического ретикулума и протеолипосомах, что позволило выявить связь конформационной подвижности белка с его АТФазной активностью, показать, что внутримолекулярная подвижность и активность Са-АТФазы зависят от природы ассоциированных с этим белком липидов.

5.
Исследование состояния фотосинтетической электрон-транспортной цепи методом длительного послесвечения хлорофилла.
При интенсивном облучении растения имеет место фотохим тушение.В ФС1 есть набор в-в, которые вз-уют по донорно-акцепторному механизму. Антенна возбуждается фотоном, происходит миграция энергии. При интенсивном облучении антенне похуй, дошел ли электрон до конца ФС, поступают еще электроны, может наступить пиздец. По интенсивности излучения определяют время релаксации. Меняя параметры можно влиять на выход флуоресценции, кпд процесса. В конечном итоге мы либо ингибируем процесс(ФС не справляется), либо варьирум его.

6.
Методы исследования электрических свойств бислойных липидных мембран и липосом.
Липосомы, или фосфолипидные везикулы (пузырьки), получают обычно при набухании сухих фосфолипидов в воде илипри впрыскивании раствора липидов в воду. При этом происходит самосборка бимолекулярной липидной мембраны. Минимуму энергии Гиббса отвечает замкнутая сферическая одноламеллярная форма мембраны. При этом все неполярныегидрофобные хвосты находятся внутри мембраны и ни один изних не соприкасается с полярными молекулами воды. Однако чаще получаются несферическиемноголамеллярныелипосомы, состоящие из нескольких бимолекулярных слоев, - многослойные липосомы.Отдельные бимолекулярные слои многослойной липосомыотделены водной средой. Толщина липидных слоев составляет, в зависимости от природы липидов, 6,5 - 7,5 нм, а расстояние между ними - 1,5 - 2 нм. Диаметр многослойных липосомколеблется в пределах от 60 нм до
400 нм и более. Однослойные липосомы можно получить различными методами, например из суспензии многослойных липосом, если обработать их ультразвуком. Диаметр однослойных липосом, полученных этим методом, составляет 25 - 30 нм. Разработаны и другие методы получения однослойных липосом, в томчисле диаметром до 400 нм и более.Липосомы представляют собой в некотором роде прообразклетки.
Они служат моделью дляисследований различныхсвойств клеточных мембран.
Клетка или липосома, несущие на поверхности электрический заряд, движутся в постоянном электрическом поле с постоянной скоростью. В переменном электрическом поле возникает т.н. диэлектрофорез. Каждая клетка обретает определённый электрический момент, в результате чего они выстраиваются по силовым линиям поля, притягиваются друг к другу и втягиваются в область максимального поля. При увеличении напряжённости клетки деформируются, а затем, в области полюсов происходит явление электропорации. Оно было досконально изучено на плоских бислойных липидных мембранах (БЛМ). Время жизни БЛМ зависит от амплитуды приложенной разности потнциалов и липидного состава. Для создания потенциала на мембранах фосфолипидных везикул к суспензии липосом в незабуференном растворе сахарозы добавляли ацетат калия. Уксусная кислота в недиссоциированной форме проникает внутрь липосом, создавая на мембране разность концентраций ионов водорода (DpH).
Эта разность концентраций препятствует дальнейшему вхождению ацетата, и липосомы сжимаются под влияние осмотического давления K
+
и Ac

снаружи. Судить о таком сморщивании липосом можно по возрастанию светорассеяния (и уменьшению светопропускания) суспензии, как это видно на рис.9
. О наступлении пробоя можно судить по резкому скачку светопропускания суспензии (DT на рис.9
), который связан с входом ацетата калия в липосому. Если отложить величину этого скачка светопропускания как функцию потенциала на мембране, рассчитанного по уравнению Нернста, то мы увидим отчетливый перелом на кривой, который соответствует потенциалу пробоя (см. рис.10
).

БЛМ:Для изучения ионной проницаемости липидного слоя мембран используют БЛМ. Для приготовления
БЛМ (см. рис. 8. 19) в стаканчик с раствором электролита помещаютвторой, тефлоновый стаканчик , в стенкекоторогосделано отверстие, диаметром около 1 мм.С помощьюкапилляра в отверстиевводятмаленькую каплю раствора фосфолипида вжидком углеводороде, гептане или гексане
(рис. 8.20, А). Молекулы фосфолипидовсобираются на поверхности капли такимобразом, что полярные головки молекулобращены в водную среду, а гидрофобныехвосты – внутрькапли (рис. 8.21, Б).
Постепеннорастворительуходитизкапли и улетучивается, а капля превращается влипидную пленку (БЛМ), рис. рис. 8.20, В, Г). В БЛМ полярные головки фосфолипидовобращены в водную фазу, а неполярныеуглеводородные цепи жирных кислот сливаются в сплошную вязкую фазу во внутреннейчасти липидной мембраны. Помногимсвойствамэтапленка сходна с липидным слоембиологических мембран.
Рис. 8.20. Установка для изучения электрических свойств бислойнойлипидной мембраны (БЛМ): 1 —
стакан с раствором электролита (2); 3 —тефлоновый стаканчик с отверстием (4); 4 — БЛМ; 5, 6 —
неполяризующиеся электроды.

Пэтч-кламп техника (точечная фиксация мембранного потенциала и
измерение токов через одиночные каналы)

7.
Метод ЭПР в исследовании внутримолекулярной подвижности.
Электронный парамагнитный резонанс- это явление резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волны системой парамагнитных частиц (электронов с некомпенсированными спинами), помещенных во внешнее магнитное поле, при резонансной частоте волны vpe3. Резонансное значение частоты v рез
=
ɡ????????????????????????

где В - индукция магнитного поля, h - постоянная Планка, g -гидромагнитное отношение, или g-фактор, зависящий от природы парамагнитных частиц. Для свободного электрона g 2. Магнетон Бора β = 0,927 •
1023 Дж / Тл. Практически удобнее оставлять частоту v электромагнитной волны постоянной, а медленно менять индукцию магнитного поля В. В ЭПР используются частоты электромагнитного поля v 1010
Гц и индукция В 0,3 Тл. Спектром ЭПР называется зависимость мощности поглощения Р электромагнитной волны от величины магнитной индукции В. Чем сильнее взаимодействие между атомами и молекулами образца, тем спектры ЭПР шире. Чем слабее взаимодействие между частицами (больше подвижность молекул), тем уже спектры ЭПР. По ширине спектров ЭПР можно судить о подвижности молекул вещества.
Так как молекулы фосфолипидов диамагнитны, для ЭПР-исследований биомембран используются спин-
зондыи спин-метки - молекулы или молекулярные группы с неспаренными электронами.
Парамагнитные спин-зонды вводятся в липидную мембрану, спектры поглощения спин-зондами электромагнитной волны дают информацию о свойствах липидного окружения, в частности о подвижности липидных молекул в мембране. Несмотря на ценную информацию, которую удалось получить при исследовании биологических объектов методом ЭПР с использованием спиновых зондов, этот метод обладает существенным недостатком - внесение в биологический объект чужеродных молекул-зондов может изменять структуру объекта.
ЭПР- и ЯМР-исследования показали, что подвижность фосфолипидных молекул в мембране сравнительно велика, а вязкость мала. В нормальных физиологических условиях липидная часть мембраны находится в жидком агрегатном состоянии. Вязкость липидной мембраны сравнима с вязкостью подсолнечного масла:
μ = (30 - 100) мПа
Изменение микровязкости липидного окружения мембранных белков-ферментов резко сказывается на их функционировании. Микровязкость мембраны у концов липидных хвостов меньше, чем около полярных голов - доказано методом ЭПР с использованием спин-меток. Спиновые метки присоединялись к разным местам фосфолипидной молекулы. В середине мембраны упорядоченность во взаимном расположении хвостов фосфолипидных молекул меньше.

8.
ЯМР-спектроскопия в исследовании внутримолекулярной подвижности.
Одним из мощных методов изучения динамики биополимеров является метод ядерного магнитного резонанса. Сущность явления ЯМР сходна в основных чертах с электронным парамагнитным резонансом.
Ядра (помимо ядер с четным числом протонов и нейтронов («четно-нечетные» ядра), к числу которых принадлежат основные изотопы углерода С12 и кислорода 16О), имеют отличные от нуля значения спина и магнитного дипольного момента мю. При этом магнитные моменты разных ядер отличны друг от друга.
Внешнее постоянное магнитное поле До приводит к ориентации магнитных моментов и в случае спина I =
1/2 к расщеплению исходного уровня на два подуровня, соответственно
В случае ЯМР условия резонанса чаще записывают как где гамма — так называемое гиромагнитное отношение или отношение магнитного момента мю к механическому — спину I.
В поле H_0 = 1 Тл резонансная частота для протонного ядерного резонанса составит v = 4,26 • 10 Гц, что соответствует диапазону метровых радиоволн и намного меньше резонансной частоты ve для электрона.
Условия резонанса для ядер, например протонов, входящих в состав молекул, будут отличаться от условий для свободного протона вследствие экранирования электронными оболочками и влияния ядер химического окружения протона. Поэтому резонансное магнитное поле в должно быть заменено эффективным полем, учитывающим влияние окружения. Кроме того, магнитные моменты различных ядер взаимодействуют между собой и электронами в молекуле, причем характер этого взаимодействия также зависит от окружения ядра. Эти факторы влияют на параметры спектра ЯМР, давая тем самым информацию о химических свойствах и внутримолекулярной динамике образца.

9.
Люминесцентные методы в исследовании внутримолекулярной подвижности.



10.
Применение методов адсорбционной спектроскопии для исследования биологических объектов в ультрафиолетовой и видимой области.
11.
Метод регистрации токов ионных каналов («пэтч-кламп» метод)
12.
Метод хемолюминесценции в исследовании генерации активных форм кислорода и перекисного окисления липидов.
13.
Метод флуоресцентных зондов в исследованиях состояния клеточных мембран и молекул.
Примеры.

14.
Применение метода спиновых зондов и меток в биологических исследованиях.
Свободные радикалы короткоживущие соединения, для того чтобы их измерить методом ЭПР в пробы добавляют спиновые ловушки: обычно ароматические нитрозосоединения– которые образуют сАФК стабильные радикалы.

15.
Модели хаотических процессов в биологии.
16.
Методы регистрации мембранного потенциала и ионных токов.
17.
Флуоресцентные методы исследования внутриклеточного рН и рСа.
18.
Методы обнаружения свободно радикальных состояний.
19.
Принцип метода моделирования молекулярной динамики белков.
20.
Флуоресцентные методы исследования состояния фотосинтетического аппарата растений.

перейти в каталог файлов
связь с админом