Главная страница
qrcode

ЗАЧЕТ Бондарев. Мутагенез. Основные мутагены применяемые в селекции. Механизм действия мутагенов. Мутагенез


НазваниеМутагенез. Основные мутагены применяемые в селекции. Механизм действия мутагенов. Мутагенез
АнкорЗАЧЕТ Бондарев.doc
Дата27.07.2018
Размер65.5 Kb.
Формат файлаdoc
Имя файлаЗАЧЕТ Бондарев.doc
ТипДокументы
#43552
Каталог

  1. Мутагенез. Основные мутагены применяемые в селекции. Механизм действия мутагенов.


Мутагенез- процесс возникновения наследственных изменений (мутаций) под влиянием внутренних или внешних естественных (спонтанных) или искусственных (индуцированных) факторов.

В зависимости от характера изменений мутации подразделяются на: генные, геномные и хромосомные. А в зависимости от места возникновения их подразделяют на генеративные и соматические. В зависимости от механизма воздействия на организм мутации бывают спонтанными и индуцированными.

Мутации, возникшие в половых клетках, называются генеративными. Генеративные мутации передаются последующим поколениям в процессе полового размножения.

Мутации, возникшие в клетках других тканей, называются соматическими. Соматические мутации по своей природе ничем не отличаются от генеративных.
Выделяют две большие группы мутагенов: физические и химические.
Физические мутагены в свою очередь подразделяются на электромагнитные (рентгеновские лучи, гамма-лучи) и корпускулярные излучения (электроны, протоны, нейтроны и альфа-частицы). Кроме указанных в качестве мутагенных факторов могут служить также ультрафиолетовые лучи и резкие понижения или повышения температуры окружающей среды.

Радиочувствительность - степень нарушения различных процессов и поражение тканей в результате влияния определенной дозы радиации. Радиочувствительность обычно оценивается критической дозой, т.е. дозой при которой выживает до 30-50 % растений. Существует понятие летальная доза, при которой наблюдается 100 % гибель растений.

Химические мутагены стали использоваться в селекции совсем недавно.

В действии ионизирующих излучений на древесные породы следует различать хотя и связанные между собой, но в то же время самостоятельные проблемы: мутабильность и радиочувствительность.

Мутабильность - способность вида, разновидности мутировать под воздействием на него внешних факторов

Механизм воздействия основывается на образовании с нуклеиновыми основаниями так называемых ДНК-аддуктов. Чем больше таких ДНК-аддуктов образуется в молекуле, тем сильнее изменяется нативная структура ДНК, что приводит к невозможности правильного протекания процессов биосинтеза белка (транскрипцию и репликацию) и тем самым порождает экспрессию мутантных белков. Практически все химические мутагены являются источниками злокачественных опухолей (обладают канцерогенностью), однако, не все канцерогены проявляют мутагенные свойства.
Спонтанные мутации. Мутации, возникшие в природе под воздействием факторов внешней среды или в результате физиологических и биохимических изменений в самом организме без воздействия человека, называются спонтанными.

Частота спонтанных мутаций варьирует очень сильно. Каждый индивидуальный ген мутирует очень редко. Однако в связи с тем, что число генов у большинства видов чрезвычайно велико, общая частота мутирования в данном поколении может быть весьма значительной.
Инду­цированный мутагенез- Более эффективен метод ис­кусственного изменения генома, что резко, на много порядков увеличивает частоту мутаций.

Инду­цированный мутагенезоснованный на использовании мутагенно­го действия ряда химических соединений (азотистая кислота, бромурацил, антибиотики и др.), нейтронных, γ-, рентгеновских и ультрафиолетовых лу­чей, ультразвука, темпера-туры, биологических мутагенов (фаги, вирусы, биотоксины).
По механизму действия все мутагены можно разделить на две группы:
1. Мутагены прямого действия, непосредственно воздействующие на ДНК;

2. Мутагены непрямого действия. Такие мутагены непосредственно на ДНК не действуют, однако они вызывают образование других веществ, которые и вызывают мутации. Например различные виды ионизирующего излучения вызывают образование в клетках пероксидных радикалов, которые в свою очередь повреждают ДНК. Мутагены непрямого действия могут так же повреждать различные специфические белки-ферменты участвующие в процессах репликации и транскрипции гена.
Эффективной технологией, позволяющей совместить возможности различных видов мутагенеза и искусственого отбора форм является ступенчатая селекция. Сущность метода состоит в том, что исходную культуру клеток, у которых интересующий человека признак развит в очень незначительной степени, обрабатывают мутагенами различной природы, что обычно вызывает резкое увеличение частоты различных мутаций. Далее среди образовавшихся мутантных форм проводят поиск (скрининг) таких, у которых интересующий полезный признак усилился. Эти клетки отбирают и получают на их основе чистую культуру, которую опять подвергают воздействию мутагенных факторов различной природы. Далее опять проводят отбор наиболее эффективных мутантов. Процедуры мутагенеза и скрининга повторяют необходимое количество раз, добиваясь существенного возрастания контролируемого показателя (активность, продуктивность и др.).

2) Иммобилизованные ферменты и клетки и преимущества их применения в биотехнологии. Методы иммобилизации ферментов (химические, физические).
Иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной оказывается лишь ограниченная часть общего объема. На практике для иммобилизации ферментов используют рутинные физические и химические методы. Все существующие методы физической иммобилизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соединяется с носителем ковалентными связями) могут быть подразделены на четыре основные группы:

· адсорбция на поверхности нерастворимого носителя (или как иногда говорят матрикса);

· включение в поры геля;

· пространственное разделение фермента от остальной части реакционной смеси с помощью полупроницаемой мембраны;

· введение фермента а двухфазную реакционную среду, в которой он растворим, но может находиться только в одной из фаз.

Эффективность ферментативных процессов, используемых в самых раз-личных областях человеческой деятельности, удалось увеличить с помощью иммобилизации ферментов. Иммобилизованные ферменты обладают не-сколькими преимуществами над своими растворимыми аналогами:

1) могут быть отделены от продукта и использованы повторно, что снижает стоимость процесса;

2) характеризуются повышенной стабильностью и длительным со-хранением активности;

3) пригодны для непрерывных процессов, которые, в свою очередь, облегчают контроль за качеством и снижают стоимость труда;

4) время реакции может быть уменьшено за счет создания более вы-сокого соотношения ферментов и субстратов;

5) возможностью создания мультиферментных систем.
Однако применение ферментов ограничено из-за их низкой стабильности, способности катализировать только одну единственную реакцию, высокой стоимости чистых препаратов. Кроме того, для практических целей могут использоваться только те ферменты, для которых не требуется регенерации кофакторов. Поэтому в настоящее время наряду с иммобилизацией ферментов внимание исследователей все больше привлекает иммобилизация клеток и органелл.

Преимущество. Живая клетка в отличие от фермента представляет собой готовый биотехнологический реактор, в котором реализуются не только процессы, приводящие к образованию конечного продукта, но и многие другие, способствующие поддержанию каталитической эффективности системы на высоком уровне (например, регенерация кофакторов). Поскольку ферменты функционируют в нативном окружении, их денатурация в процессе работы сводится к минимуму.

Недостатки. Например, клеточная стенка или плазматическая мембрана могут препятствовать проникновению субстрата к ферменту или диффузии продукта из клетки. Кроме того, возникает необходимость поддержания целостности клеток и удержания их в той фазе роста, в которой синтезируются требуемые ферменты. Наконец, из-за большого числа присутствующих в клетке ферментов (что в ряде случаев рассматривается как достоинство) возможно протекание нежелательных побочных реакций.
Два типа носителей: ОРГАНИЧЕСКИЕ И НЕОРГАНИЧЕСКИЕ

Органические полимерные носители

два класса:

1 - природные полимеры (подразделяются на группы в соответствии с их биохимической классификацией: полисахаридные, белковые и липидные носители.)

Агар - природный полисахарид, выделяемый из клеточных стенок некоторых морских водорослей. Точный состав его не известен, но установлено, что он содержит, по крайней мере, два полисахарида: агарозу и агаропектин. Преимуществом агара является его низкая стоимость и нетоксичность.

Хитин - природный аминополисахарид, напоминающий некоторым образом целлюлозу и является компонентом наружного скелета ракообразных, насекомых, а также входит в состав оболочек некоторых грибов. Являясь отходом промышленной переработки креветок и крабов, данное соединение имеется в достаточно больших количествах при относительно низкой стоимости. Препараты обладают высокой каталитической активностью и устойчивы к микробному воздействию.

Целлюлоза. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют, что делает ее относительно дешевым и удобным для иммобилизации различных ферментов носителем. Однако она неустойчива к действию сильных кислот, щелочей и некоторых окислителей, что ограничивает области ее применения.

2 - синтетические полимерные носители. (группы: полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные носители), используются для получения гелей и микрокапсул.

Применение природных полимеров в качестве носителей аргументируется их доступностью и наличием свободных функциональных групп, легко вступающих в разнообразные химические реакции, а также их высокой гидрофильностью. К недостаткам следует отнести неустойчивость к воздействию некоторых микроорганизмов и относительно высокую стоимость многих из них.
Неорганические носители создаются на основе силикагеля, глины, керамик, природных минералов, металлоы, уголь.

Основными качествами, определяющими широкое внедрение неорганических носителей в производственные процессы, является легкость их регенерации и возможность придания им любой конфигурации. Они могут применяться как в виде порошков, шариков, так и монолитов; они могут быть как пористыми, так и сплошными (непористыми).

Достоинства микропористых кремнеземов следует отнести механическую прочность, химическую инертность по отношению ко многим растворителям, наличие жесткого скелета с заданным размером пор, а также устойчивость к микроорганизмам.

Недостатками кремнеземов является их использование в ограниченном диапазоне рН, а также явление неспецифической сорбции на их поверхности, хотя последнее может быть устранено различными модифицирующими воздействиями. Очень дорогие.

3) Способы культивирования продуцентов
Культивирование бывает:

А) поверхностное и глубинное;

Б) Цикличная и нецикличное.
Существует четыре основных модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов.
1. Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментаторе, после чего ферментатор освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.

2. Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментаторах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости в ферментаторе и доводится свежей питательной средой до исходного уровня.

3. Батарейный способ. Микроорганизмы развиваются в ряду последовательно соединенных ферментаторов. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментатора во второй, затем из второго в третий и т. д. Освобожденный ферментатор немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов емкости используются более рационально.

4. Непрерывное культивирование. В основе метода лежит принцип непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. Стадия развития микроорганизма определяется тем, что в этот период происходит максимальный биосинтез антибиотика или другого биологически активного соединения.

Установлено, что в условиях непрерывного процесса биосинтеза некоторых антибиотиков можно получить хорошие результаты, если процесс вести в две стадии. В первом аппарате батареи поддерживают высокую скорость потока, обеспечивающую большую скорость роста продуцента антибиотика, с тем, чтобы получить высокоактивную биомассу, а во втором аппарате - обеспечивают низкую скорость потока и соответственно небольшую скорость роста. Процесс непрерывного культивирования - перспективное направление современной биотехнологии.


Поверхностный метод культивирования продуцентов ферментов
При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые частицы, клетки получают питание за счет содержащихся в этих средах веществ и используют для дыхания кислород воздуха, поэтому для их нормального обеспечения кислородом приходится применять рыхлые по своей структуре среды с очень небольшой высотой слоя. Это приводит к необходимости иметь большую поверхность контакта рыхлой среды с воздухом и при отсутствии механизации придает всему процессу неинтенсивный характер, требует больших затрат ручного труда.

Так, например, для завода, вырабатывающего 1 т поверхностной культуры плесневых грибов на пшеничных отрубях, при двухсуточном росте требуется более 1000 отдельных кювет, на которых тонким слоем раскладывается засеянная конидиями гриба питательная среда. Мойка, стерилизация, перемещение кювет внутри цеха, их заполнение и освобождение составляют ту основную трудность, которая характерна для данного метода.

Выращивание производственной культуры происходит обычно в неасептических условиях, однако как сама среда, так и кюветы первоначально должны быть надежно стерилизованы. Это требование является безусловным, кроме того, перед каждой новой загрузкой должны дезинфицироваться растильные камеры, а также все мелкое оборудование и инвентарь.

Поверхностный метод имеет и преимущества, самое главное из них — значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массы среды. Например, для осахаривания 100 кг крахмала в спиртовом производстве требуется 5 кг поверхностной культуры плесневых грибов или около 100 кг культуральной жидкости. Поверхностные культуры можно быстро и относительно легко высушить, их легко перевести в товарную форму и транспортировать, если не требуется дополнитель­ной очистки фермента. Положительной стороной поверхностного метода является также меньшая потребность в электроэнергии по сравнению с глубинным методом.
перейти в каталог файлов


связь с админом