Главная страница

[Медкниги]1orel_n_m_biokhimiya_lipidov. Практикум для студентов биологического факультета специальности 1-31 01 01 Биология


Скачать 316.5 Kb.
НазваниеПрактикум для студентов биологического факультета специальности 1-31 01 01 Биология
Анкор[Медкниги]1orel_n_m_biokhimiya_lipidov.doc
Дата19.10.2017
Размер316.5 Kb.
Формат файлаdoc
Имя файла[Медкниги]1orel_n_m_biokhimiya_lipidov.doc
ТипПрактикум
#29315
страница1 из 4
Каталогid227763829

С этим файлом связано 1 файл(ов). Среди них: [Медкниги]1orel_n_m_biokhimiya_lipidov.doc.
Показать все связанные файлы
  1   2   3   4



БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра биохимии

▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬
БИОХИМИЯ

ЛИПИДОВ
Практикум для студентов биологического факультета

специальности 1-31 01 01 «Биология»,

специализации 1-31 01 01 – 05 «Биохимия»


▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬

МИНСК

2007
УДК 577 : 612.

ББК в.р.

Б 63
Составитель

Н. М. Орел
Рекомендовано

Ученым советом

биологического факультета

6 октября 2006 г., протокол № 2

Рецензенты:

кандидат биологических наук, доцент Р. А. Желдакова;

кандидат биологических наук, доцент Е. А. Храмцова
Биохимия липидов : практикум для студентов биол. фак. спец. 1-31 01 01 «Биология», специализации 1-31 01 01 – 05 «Биохимия» / сост. Н. М. Орел. – Минск: БГУ, 2007. 35 с.
В практикуме приводятся методы количественного определения разных классов липидов в тканях, способы их разделения методами хроматографии, колориметрические методы исследования липидов.

Для студентов биологического факультета БГУ специальности 1-31 01 01 «Биология», специализирующихся на кафедре биохимии.
УДК 577 : 612

ББК в.р.

© БГУ, 2007

ПРЕДИСЛОВИЕ
В экспериментальной биохимии находят применение огромное число методов их модификаций. Само собой разумеется, что с разработкой новых многие ранее используемые методы теряют свое значение в силу недостаточной специфичности или чувствительности, недоступности некоторых реактивов или излишней сложности. Разобраться в нагромождении методических рекомендаций без серьезной практической подготовки достаточно трудно. Настоящий практикум позволяет освоить соответствующие требованиям современной науки методические приемы выделения, разделения и количественного определения основных классов липидов и их отдельных представителей.

Главное место в пособии отведено описанию наиболее широко используемых приемов анализа общей фракции липидов, фосфолипидов, гликолипидов, жирных кислот, холестерина в органах и тканях животного организма. Предполагается, что студентом будут выполнены 3–4 работы. Они подбираются так, что дают возможность на практике для исследования липидов применить хроматографические, фотоэлектроколориметрические, спектрофотометрические методы.

При выполнении каждой работы студент должен самостоятельно сделать расчеты, приготовить все необходимые растворы, провести эксперимент, оформить результаты в виде отчета, проиллюстрировать полученные данные таблицами и графиками, оценить достоинства и недостатки метода и результаты собственной работы.

ОСНОВНЫЕ ПРИЕМЫ РАБОТЫ

С ЛИПИДАМИ

Липиды – вещества, имеющие различное химическое строение, но обладающие общим свойством: высокой растворимостью в неполярных растворителях. Они играют важную роль в процессах жизнедеятельности: образуют энергетический резерв, создают защитные термоизоляционные и водоотталкивающие покровы у животных и растений, защищают органы и ткани от химических воздействий. Являясь одним из основных компонентов биологических мембран, липиды влияют на их проницаемость, участвуют в передаче нервного импульса, создают межклеточные контакты, выполняют функцию вторичных мессенджеров в передаче сигналов в клетку. К липидам относятся многочисленные вещества гормональной природы (стероиды), а также холестерин, желчные кислоты и другие соединения. Различают нейтральные липиды (свободные жирные кислоты и их эфиры, моно-, ди- и триацилглицерины, стероиды, воски, терпены) и полярные липиды (глицерофосфолипиды, сфинго- и гликолипиды, цереброзиды).

При экстракции липидов принимают во внимание то, что они способны не только к гидрофобным взаимодействиям, но и к образованию водородных, электростатических и ковалентных связей (сложно-эфирных, амидных, гликозидных). Относительно неполярные растворители (хлороформ, бензол, диэтиловый эфир) разрушают комплексы, образованные гидрофобными взаимодействиями в жировой ткани, хиломикроны, комплексы альбумина с жирными кислотами. Полярные растворители (этанол, метанол) разрушают водородные и электростатические связи. Их применяют в смеси со слабополярными растворителями при экстракции липидов из плазматических мембран, митохондрий, эндоплазматического ретикулума и других органоидов. Липиды, находящиеся в комплексах, образованных ковалентными связями, растворителями не экстрагируются. Их можно выделить только после гидролиза комплекса слабыми растворами кислот или щелочей в органическом растворителе.

Наиболее распространенным методом экстракции липидов является метод, предложенный Дж. Фолчем с соавторами (1951, 1958).

1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ОБЩЕЙ ФРАКЦИИ ЛИПИДОВ ПО МЕТОДУ ФОЛЧА

Принцип метода: липиды экстрагируют из тканей или выделенных субклеточных образований хлороформ-метаноловой смесью, экстракт отмывают от водорастворимых примесей и высушивают, после чего определяют массу осадка.

Реактивы: смесь растворителей хлороформ – метанол (2 : 1).

Ход определения: навески тканей: мозг – 200 мг, другие ткани – 300 – 350 мг помещают в мерную колбу объемом 25 мл с притертой пробкой, куда наливают 10–15 мл свежеприготовленной смеси хлороформа и метанола (2 : 1). Содержимое колбы энергично перемешивают в течение 3–5 мин, доводят хлороформ–метаноловой смесью до метки, снова перемешивают и через 5–10 мин фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Для проверки полноты экстракции липидов необходимо повторное экстрагирование. Для этого остаток ткани на фильтре обрабатывают дополнительно 5 мл смеси хлороформа и метанола (2 : 1). Обычно при этом в экстракте не удается обнаружить присутствия липидов, что свидетельствует о полноте экстракции.

Для удаления нелипидных водорастворимых примесей, извлеченных хлороформ-метаноловой смесью, липидный экстракт промывают дистиллированной водой. В небольшой стаканчик, высотой 6–7 см и диаметром 3 см, наливают 10–20 мл дистиллированной воды; в этот же стаканчик специальной пипеткой объемом 10 мл, соединенной с резиновой грушей или шприцем, переносят липидный экстракт в количестве 10 мл, причем кончик пипетки должен быть опущен под воду (при этом следует избегать бурного перемешивания жидкостей). Затем в стаканчик доверху доливают воду и опускают на дно большого сосуда, содержащего 500–600 мл воды. Большой сосуд закрывают стеклом и систему оставляют на ночь. При этом водорастворимые примеси диффундируют в воду. На следующий день в системе ясно различаются три фазы: верхняя – водно-метаноловая (прозрачная), нижняя – хлороформная (мутная), а на границе между ними – более или менее плотная, в зависимости от исследуемой ткани, белая пленка, содержащая липиды.

Маленький стаканчик вынимают из сосуда, верхний водно-метаноловый слой осторожно отсасывают с помощью автоматической пипетки или пипетки с грушей таким образом, чтобы не повредить белую пленку; после отсасывания над пленкой обычно остается слой жидкости в 2–3 мм. Следует отметить, что часть (небольшая) липидов теряется с водно-метаноловой фракцией.

В стаканчик приливают по каплям 3 мл метанола для растворения пленки. Если при этом пленка полностью не растворяется и раствор не становится прозрачным, то снова добавляют метанол по каплям до тех пор, пока муть не исчезнет. После растворения липидной пленки раствор количественно переносят в предварительно взвешенный на аналитических весах сухой и чистый бюкс, в котором производят высушивание липидного экстракта. Сначала ведут выпаривание на водяной бане, а затем сушат в термостате при 50–60 °С до постоянной массы. Параллельное высушивание проб в вакуумном эксикаторе дает такие же результаты. После повторного взвешивания бюкса с осадком липидов определяют массу этого осадка. Содержание липидов рассчитывают в г/кг массы исследованного органа (учесть разведение).

2. РАЗДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ ФРАКЦИИ ЛИПИДОВ

МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Тонкослойная хроматография – это эффективный, преимущественно аналитический метод быстрого разделения низкомолекулярных веществ: липидов, аминокислот, нуклеотидов, витаминов и др. Исследуемый образец наносят на тонкий слой силикагеля, закрепленного на пластинке из фольги, пластика или стекла. Пластинку помещают в хроматографическую камеру с небольшим количеством растворителя. Фронт растворителя поднимается по пластинке под действием капиллярных сил, увлекая вещества, содержащиеся в образце. Скорость продвижения разделяемых веществ зависит от их распределения между неподвижной (гидрофильный силикагель) и подвижной (неполярный растворитель) фазами и растворимости в последней. Хроматографический процесс заканчивают в тот момент, когда растворитель достигает верхнего края пластинки. Пластинку с силикагелем высушивают, анализируемые вещества проявляют с помощью соответствующих красителей. Для каждого вещества разделенного образца рассчитывают величину Rf . Полученные значения Rf сравнивают со значениями Rf контрольных веществ (свидетелей) и идентифицируют соединения, присутствующие в образце.
Приготовление пластинок.. Пластинки тонкого закрепленного слоя силикагеля готовят заранее следующим образом.

Стеклянные пластинки (лучше фотопластинки) размером 17,5 · 13 см тщательно моют свежеприготовленной хромовой смесью и ополаскивают много раз водопроводной водой, затем 3–5 раз дистиллированной, вытирают чистой марлей, протирают этиловым спиртом и хранят в чистом полиэтиленовом пакете в отдельной коробке.

Неподвижной фазой при разделении служит силикагель KСK, для закрепления силикагеля используют химически чистый гипс – CaSО4. Силикагель измельчают в шаровой мельнице с фарфоровыми шарами. Шары предварительно моют соляной кислотой и водой. Обычно 1 кг силикагеля перемалывают около 5 ч. Затем силикагель просеивают через металлическое или капроновое сито (100–200 меш) и хранят в склянке с притертой пробкой. (Размеры частиц адсорбента, силикагеля определяют условными единицами меш. По числу меш, приходящихся на 2,54 см длины сита, определяют размеры отверстий сита. При 50 меш размеры отверстий будут равны 0,254 мм, при 60 – 0,211, при 150 – 0,084, при 200 – 0,063 мм. Поэтому для получения определенного размера частиц используют соответствующие сита). Гипс также размалывают или растирают в ступке и просеивают через сито.

Для приготовления сорбционной массы 6 г силикагеля и 0,35 г гипса энергично встряхивают 3–5 мин в колбочке (можно с резиновой пробкой, защищенной пленкой). Смесь высыпают в ступку, постепенно, при тщательном растирании, небольшими порциями по 3–5 мл добавляют дистиллированною воду – всего 15–17 мл. Смешивание силикагеля и гипса с водой заканчивают в течение 1,5–2 мин (следить по секундомеру). Полученная масса должна быть однородной и без пузырьков воздуха.

Готовую смесь тонкой непрерывной струей выливают в центр пластинки и покачиванием пластинки распределяют ее ровным слоем по всей поверхности. Пластинку сушат при комнатной температуре 24 ч на столике с уровнем, а затем активируют в сушильном шкафу при 105 °С в течение 40 мин. Если пластинки не используют сразу, их хранят в эксикаторе над CaCl2.

Подготовка хроматографической камеры. Разгонку общей фракции липидов проводят смесью растворителей гексан – диэтиловый эфир – ледяная уксусная кислота в соотношении 78 : 25 : 2 или гексан–диэтиловый эфир–муравьиная кислота в соотношении 80 : 80 : 2 в любом герметически закрытом сосуде с плоским дном. (Крышку можно притирать к краю стенки сосуда смазкой.) Стенки камеры для лучшего насыщения выстилают фильтровальной бумагой и в камеру наливают смесь растворителей. Во время разгонки бумага на вид должна быть сухая. Следите, чтобы она не погружалась в растворитель, иначе последний будет перетекать на пластинку. Плотно закрытую камеру оставляют на 2–3 ч для насыщения парами растворителя.

Нанесение экстракта на пластинку. Липиды, выделенные из тканей, растворяют в 1 мл хлороформа. Хлороформный экстракт липидов наносят на пластинку с помощью микропипетки. Линия старта должна быть на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки, расстояние между точками нанесения 1–2 см (не менее). Раствор наносят очень маленькими каплями, не прикасаясь пипеткой к пластинке, либо в одну точку, либо узкой горизонтальной полоской (8 мм), капля к капле. Общий объем наносимого экстракта–0,05–0,1 мл.

На эту же пластинку в отдельные точки наносят свидетели: 1 % хлороформные растворы холестерина, фосфатидилэтаноламина и триацилглицеринов (свиное сало) в количестве 0,04–0,05 мл. Величина Rf зависит от количества нанесенного на пластинку вещества, (лучший результат достигается при нанесении на пластинку 0,5–1,0 мг вещества). В случае необходимости разделения больших количеств веществ можно использовать препаративное разделение липидов методом тонкослойной хроматографии. Этим способом можно разделить 50 мг и более смеси веществ.

Разделение и проявление. После нанесения липидов пластинку помещают в камеру, погружая ее в растворитель на 5 мм. Камеру герметически закрывают. Разгонка продолжается 50–60 мин при комнатной температуре. Подъем жидкости не должен быть выше 10–12 см, так как при большом подъеме происходит диффузия пятен и наблюдается колебание величины Rf. После разгонки пластинку высушивают на воздухе в течение 30 мин. Хроматограмму проявляют, осторожно опрыскивая из стеклянного пульверизатора 10 % спиртовым раствором фосфомолибденовой кислоты, и затем, через 1–2 мин выдерживают ее в сушильном шкафу при температуре 80–100 °С до появления на желтом фоне синих пятен липидов. Избыток проявителя может привести к заметному увеличению окраски фона.

Расположение липидов на хроматограмме следующее: отчетливо обнаруживаются 7–8 пятен. В первом пятне у старта находятся фосфоглицериды, выше – не идентифицированные соединения, в третьем пятне содержится холестерин, затем моно-, ди-, триацилглицерины соответственно, в последнем пятне – эфиры холестерина. Между ди- и триацилглицеринами располагаются свободные жирные кислоты, но они не проявляются фосфомолибденовой кислотой (проявители свободных жирных кислот: родамин или 0,2 % спиртовой раствор 2,6-дихлорфлуоресцина в ультрафиолете). Вместо фосфомолибденовой кислоты можно использовать способ проявления липидов в парах йода. В последнем случае проявляются все липиды. Для этого сухую пластинку помещают на несколько минут в закрытый сосуд (можно эксикатор), наполненный кристаллами йода (под тягой!).

3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ФОСФОЛИПИДОВ В ТКАНЯХ

Фосфолипиды широко распространены в животных и растительных тканях, микроорганизмах, являясь главным компонентом клеточных мембран. В составе запасных отложений встречаются редко и в небольших количествах. Молекула фосфолипидов образована остатком глицерина (реже пропандиола или этандиола) или сфингозина, жирных кислот, фосфорной кислоты, соединенной фосфорноэфирной связью с какой-либо полярной группой. В зависимости от строения полярной группы глицерофосфолипиды делятся на фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилсерины, фосфатидилинозитолы, фосфатидилглицеролы, дифосфатидилглицеролы. Подгруппа глицерофосфолипидов – плазмалогены (или фосфатидали) отличаются от других только тем, что имеют в С1 положении L-глицеро-3-фосфата не остаток жирной кислоты, а α,β-ненасыщенный спирт, присоединенный простой эфирной связью. Полярная группа в плазмалогенах чаще всего представлена холином, этаноламином или серином.

Самыми распространенными сфингофосфолипидами являются сфингомиелины – фосфохолиновые производные церамидов. Остаток жирной кислоты в церамиде присоединен к аминогруппе. Особенно богаты сфингомиелинами мембраны нервной ткани, в частности мозга. Фосфолипиды растворимы в органических растворителях, но избирательно: одни – в диэтиловом эфире, другие – в этаноле, третьи – в бензоле. Большинство из них нерастворимо в ацетоне, что позволяет отделить их от других липидов. Они способны набухать в воде и окисляться на воздухе.

3.1. Извлечение фосфоглицеридов из мозга

Принцип метода: гомогенат ткани обрабатывают раствором три-хлоруксусной кислоты для удаления нелипидных примесей. Затем из осадка производят экстракцию фосфоглицеридов этанол-эфирной и хлороформ-метаноловой смесями.

Реактивы: 1) 2,5 % и 5 % растворы трихлоруксуоной кислоты; 2) смесь растворителей этанол – диэтиловый эфир (3 : 1); 3) смесь растворителей хлороформ – метанол (2 : 1); 4) этанол; 5) ацетон ; 6) диэтиловый эфир.

Ход определения: навеску ткани от 1 до 4 г (мозг), превращают в гомогенную массу с помощью гомогенизатора или тщательно растирают в ступке, помещенной в сосуд со льдом. Гомогенизированную ткань переносят в центрифужную пробирку, куда предварительно приливают (из расчета на 1 г ткани) 10 мл охлажденного до 0 оС 5 %раствора трихлоруксусной кислоты и тщательно перемешивают.

Далее производят центрифугирование в течение 7–10 мин при 3000–4000 об/мин, после чего надосадочную жидкость удаляют, полученный осадок многократно (10–12 раз) промывают охлажденной 2,5 %трихлоруксусной кислотой из расчета 5 мл на 1 г ткани. Далее, для удаления трихлоруксусной кислоты осадок многократно (8–10 раз) промывают охлажденной дистиллированной водой и высушивают ацетоном и эфиром, которые берут из расчета 5 мл на 1 г ткани. После этого производят экстракцию фосфолипидов из осадка, для чего берут 20 мл свежеприготовленной спирт-эфирной смеси (3 : 1) и экстрагируют при 60 °С в течение 3 мин. Осадок отделяют и из него производят экстракцию хлороформ-метаноловой смесью (30 мл) в течении 30 мин при 64 °С на водяной бане с обратным холодильником. Поскольку ацетон и эфир, используемые для просушки осадка, частично растворяют фосфолипиды, их также следует объединить с хлороформ-метаноловым экстрактом. Спирт-эфирный и хлороформ-метаноловый экстракты (если необходимо, их объединяют) сливают в мерные колбы на 100 мл и доводят до метки. Полученный фосфолипидный экстракт используют для количественного определения фосфолипидов, (например, по фосфору).
  1   2   3   4

перейти в каталог файлов
связь с админом